Hoe kan je myofibers kleuren met een Phalloidin staining?
Hallo
Ik probeer al enkele keren myofiber (een 3D tissue van stamcellen opgelost in een hydrogel) te kleuren met een phalloidin kleuring. De bedoeling is om het actine skelet van de cellen te visualiseren.
We volgen volgend protocol:
1 Obtain formaldehyde fixed cultures. (1hr 4% formaldehyde, room temperature (RT))
2 Rinse cells with PBS 3 x. 7.3 Add –20°C methanol to wells for 20 min in freezer (-20°C).
4 Rinse with PBS, 3 x 5 min.
5 Block with blocking buffer, 2 h at RT.
6 Add tropomyosin primary antibody diluted 1:100 overnight at 4 °C.
7 Rinse with PBS 3 x 5 min.
8 Work in a darkened room (lights out + aluminium foil), make Alexa Fluor 488 secondary antibody by diluting 1:200 in blocking buffer.
9 Continue to work in the dark for the remainder of the procedure, add secondary antibody to wells, place plate in a light tight box or wrap in foil, and incubate 3 h at RT.
10 Rinse with PBS, 3 x 5 min.
11 Incubate with DAPI 1/10 000 in PBS for 1hr at RT.
12 View and analyze within 48 hr before fluorescence has faded significantly.
Er is een aspecifieke kleuring te zien met de (confocale) microscoop. De DAPI kernen zijn goed, maar de phalloidin staining is aspecifiek (overal kleine puntjes van het fluorecent antilichaam).
Waar zou het probleem kunnen liggen? Ik heb eens opgezocht en dit is een veel gebruikte methode en vaak met hetzelfde stramien.
Wat zijn de meest voorkomende fouten? Wat zou er hier mislopen? Is het actineskelet vernietigd?
Alvast bedank
Heb je meer informatie nodig om de vraag te beantwoorden? Reageer dan hier.